1、細胞復蘇
將凍存細胞從液氮中取出后,在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。將融化的細胞移入離心管中,加入37℃預熱的DMEM*培養基中(其中胎牛血清約為10%),輕輕吹勻,離心,500g離心2min,棄上清液。
加入DMEM*培養基清洗,棄上清液。加入DMEM*培養基,輕輕吹打混勻,制成細胞懸液,接種于培養皿/瓶中,在含5% CO2的細胞培養箱中培養。
2、細胞傳代
當細胞密度達到80%~90%(過早產量不足,過晚細胞狀態不佳,1:2至1:10以上的比率傳代培養,一般1:3至1:5細胞一代,即從細胞接種到分離再培養的一段時間,非細胞有絲分裂次數)時,去掉*培養基,用1X PBS清洗2次。
加入胰蛋白酶(注意:消化液的量以蓋住細胞,消化溫度是37℃。顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察消化細胞,若胞質回縮,細胞之間不再連接成片,表明此時細胞消化適度)進行消化,放入細胞培養箱中約2-3min。
加入適量DMEM*培養基終止胰蛋白酶消化,轉移至離心管后500g離心2min,棄上清液,再加入DMEM*培養基清洗,棄上清液。
加入DMEM*培養基,輕輕吹打混勻,吸取10微升進行計數,然后按照所需細胞量在含5% CO2的細胞培養箱繼續培養。
3、細胞凍存
當細胞密度達到80%~90%時,去掉*培養基,用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶進行消化,放入細胞培養箱中約2-3min。加入DMEM*培養基終止胰蛋白酶消化,轉移至離心管后500g離心2min,棄上清液,再加入DMEM*培養基清洗,棄上清液。加入lml凍存液(90%胎牛血清,10%DMSO。 一般來講血清含量可以在10%-90%之間調整,凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營養,另一方面可以在細胞凍存過程中提供非滲透性保護物質,如蔗糖,白蛋白等從而更好地保護細胞),放入凍存管內(管內有異丙醇,以保證溫度降低的速度),立即放入4℃冰箱中凍存30min,然后放入-20℃冰箱中凍存30min,再置于-80℃冰箱內過夜。
第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放人液氮,可以保存三個月。
細胞凍存和復蘇的原則是:慢凍速融,這樣更加有利于保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑,會導致細胞內冰晶的產生,從而使細胞產生內源性的機械損傷,引起細胞內環境滲透壓,PH,電解質等的改變,進而促使細胞死亡。